Synonym

Englisch

OPSI

Methode

Bei der KBR wird als Antigen ein Cardiolipin-Lecithin- Cholesterin-Gemisch verwendet. Cardiolipin ist ein Phospholipid, gewonnen aus Herzmuskelgewebe eines Rinderherzens. Sind im Serum des Patienten Antikörper, sog. Reagine (antilipoidale AK), enthalten, kommt es zu einer Antigen-Antikörperkomplex-Bildung und somit zu einer Konformationsänderung der Fc-Teile der Antikörper. Bei der Card.- KBR bewirkt diese AG-AK-Komplexbildung einen unspezifischen Komplementverbrauch durch eine klassische Aktivierung. Das Komplement (= unspezifischer Reaktant des humoralen Abwehrsystems ) steht dann für die Reaktion mit dem hämolytischen Indikatorsystem bestehend aus Schafserys und Ambozeptor (AK gegen Schaferys, Hämolysin) nicht mehr zur Verfügung. Im positiven Fall bleiben somit die Schaferys erhalten und werden nicht hämolysiert. Im negativen Fall werden die Erys hämolysiert, da das Komplement vorher nicht verbraucht wurde und noch die mit Ambozeptor beladenen Schafserys hämolysieren kann.

Geschichte

Indikationen

Vorbereitung

1. Kontroll-Seren ( eingefroren ) vorbereitend:
   Grundverdünnung herstellen 1:10
   10 μl pos. KO-Serum + 90 μl VP (Veronalpuffer)
   10 μl neg. KO-Serum + 90 μl VP (Veronalpuffer)
   
2. Patienten-Seren ( eingefroren ) vorbereiten:
   Grundverdünnung herstellen 1:5
   25 μl Pat.1serum + 100 μl VP
   25 μl Pat.2serum + 100 μl VP
   -> für jeden Patient (für Doppelbestimmung doppelte Menge ansetzten!)
   
3. Verdünnte KO- und Pat.-Seren 30 min. bei 56°C im Wasserbad inkubieren (dadurch wird eigenes Komplement inaktiviert)
4. Cardiolipin-AG vorbereiten (liegt gelöst vor) 1:120 verdünnen
   15 μl AG + 1785 μl VP
   
5. U-Mikrotiterplatte vorbereiten
   
6. 5-10 min. bevor Serum fertig inkubiert hat Komplementverdünnung (2E) herstellen
   2 Einheiten entsprechen einem Verdünnungsfaktor von 1:50
   für eine Platte : 40 μl Komplement + 1960 μl VP (im Reagenzglas ansetzten)
   => Reagenzglas in Eis stecken
   
7. Komplementverdünnung für Komplement-KO ansetzen (in Eppendorfhütchen)
   1,5 E : 50 μl VP + 150 μl Kompl.(2E)
   1,0 E: 100 μl VP + 100 μl Kompl.(2E)
   0,5 E: 150 μl VP + 50 μl Kompl.(2E)
   => Eppendorfhütchen in Eis stecken
   

Pipettierschema

Durchführung

1. 25 μl VP vorlegen: 1./3./4./5./6. Delle einer jeden Reihe und in alle 4 Komplement-KO
2. 25 μl pos. KO-Serum in 1./2./3. Delle der 1. Reihe
   25 μl neg. KO-Serum in 1./2./3. Delle der 2. Reihe
   25 μl Pat.-Serum in 1./2./3. Delle der 3. Reihe
   Verdünnungsreihe anlegen: je 25 μl übertragen von 3.->4.-> 5.->6. /` 25 μl verwerfen
   bei jeder Reihe gleich verfahren
3. 25 μl verdünntes AG (1:120 ) in 2.-6. Delle in allen Reihen und in alle Komplement-KO
4. 25 μl Komplement-Verdünnung (2E) in alle Dellen ( pos.KO, neg.KO, SerumKO und Pat.)
5. 25 μl Komplement-Verdünnung ( 1,5/ 1,0/ 0,5E) in entsprechende Delle der Komplement-KO
6. Rüttler: 10 sek. schütteln
7. Inkubation: 60 min. bei 37°C abgedeckt im Brutschrank
8. Ambozeptor-Gebrauchsverdünnung herstellen 1:25 60 μl Stammlösung + 1440 μl VP
9. Hämolytisches System ansetzen ( für eine Platte )
   1,5 μl Ambozeptor + 1,5 μl Erythrozyten ( 1%, gebrauchsfertig, gut mischen)
   Mischung schwenken (Erys gehen beim Schütteln kaputt!) und 15 min. bei 37°C inkubieren
   ( = sensibilisieren)
10. 50 μl hämolyt. System in alle Dellen pipettieren
11. Rüttler: 10 sek. schütteln
12. Inkubation: 30 min. bei 37°C zugedeckt im Brutschrank (alle 10 min. rütteln)
13. Rüttler: 10 sek. schütteln
14. Zentrifugieren: 5 min. bei 2000 U/min.
15. Ablesen:
    positiv: Sedimentierung der Erys (Knopfbildung )
    negativ: vollständige Hämolyse der Erys ("klar")
    
    Serum-Kontrolle: muß immer negativ sein, da sie kein Antigen enthält!
    Ist sie doch positiv, gilt das Serum als antikomplementär,d.h. falsch positiv! Das Ergebnis dieser Probe darf nicht bewertet werden!
    pos. KO: muß vorab bestimmten Titer aufweisen ( z.B. 1:40 )
    neg. KO: muß negativ sein
    Patienten-Seren: als Titer wird die höchste Verdünnung angegeben, bei der es noch zu einer deutlichen Knopfbildung (= Hemmung der Hämolyse ) kommt. Erfolgt überhaupt keine Knopfbildung, hat der Patient keine Antikörper
    Komplement-KO:
    • 2,0E: vollständige Hämolyse
    • 1,5E: vollständige Hämolyse
    • 1,0E: Hemmung der Hämolyse
    • 0,5E: Agglutination ( Knopf )
    
    1 Einheit Komplement reicht, um alle Erys des Testsystems zu hämolysieren

Normalwerte

pos. KO: Titer 1:80
neg. KO: negativ
Serumkontrolle: negativ
Komplementkontrolle:

• 2,0E: vollständige Hämolyse
• 1,5E: vollständige Hämolyse
• 1,0E: Hemmung der Hämolyse
• 0,5E: Agglutination (Knopf)

Meßfehler

Fehlerquellen:

1. Kein Plasma verwenden. Vorhandene Gerinnungsfaktoren stören die KBR. Bei Einsatz von Citrat- und EDTA-Plasma wird die Konzentration an wichtigen Ionen für die KBR reduziert. (Ca2+ und Mg2+ sind für die Aktivierung der Komplementkaskade erforderlich.)
2. Alle Seren vor dem Einsatz inaktivieren.
   Seren erst verdünnen ( Pat.seren 1:5 ; Koseren 1:5 ), dann inaktivieren. Auch Punktate und Aszites müssen inaktiviert werden, Liquor kann nativ eingesetzt werden. Bereits inaktivierte Seren müssen nach Lagerung nochmals 10min. inaktiviert werden (Komplementregeneration)
3. Eigenhemmung entsteht durch antilipoidale Serumeigenschaften und zeigt sich durch Knopfbildung in der Serumkontrolle ( -> enthält kein Antigen => müßte negativ sein)
   Ursachen:
   1. Serumfaktoren
      • aggregiertes Immunglobulin durch wiederholtes Tauen und Frieren
      • hämolytisches Serum
      • bakterielle Kontamination
   2. Pathophysiologische Faktoren
      • zirkulierende Immunkomplexe
      • Rheumafaktoren
      • Pharmarka (v.a. Dextrane)
   
   
4. Veronalpuffer immer geschlossen und kühl aufbewahren, um pH-Verschiebungen zu vermeiden.
5. Antigen und Komplement bis zum Gebrauch im Kühlschrank lagern!
6. Inkubation: Soll-/Ist-Temperatur von Wasserbad und Brutschrank überprüfen
7. Erythrocyten und hämolytisches System gut mischen (nicht auf Mixer, sonst gehen Erys kaputt!) und vor Pipettieren aufmischen, da Erys sich schnell absetzen.
8. Erythrozyten nur verwenden, solange der Überstand klar ist.

Interpretation

Die Card.KBR wird meist als Verlaufs- oder Therapiekontrolle bei Treponemeninfektionen eingesetzt, da

• im Frühstadium der AK-Nachweis nur schwer möglich ist, im Sekundärstadium, aber alle Patientenseren reaktiv sind
• die Card.KBR eine recht große Zahl falsch positiver Ergebnisse durch unspezifische Ereignisse aufweißt, da antilipoidale Antikörper auch bei einem entzündungsbedingten Zerfall gebildet werden (Malaria, Lepra, infektiöse Mononukleose, Masern, Schwangerschaft)

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Autor

Sabine Petersdorf

Erstellt

15.12.2003

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