Vorbereitung

1. Wasserbad auf 56°C und Brutschrank auf 37°C stellen
2. Vor Gebrauch alle Testkomponenten auf Raumtemperatur bringen
3. Reaktives Kontrollserum (Lyophilisat) mit 1,0 ml A.dest. rekonstituieren
4. Unspezifisches Kontrollserum (Lyophilisat) mit 1,0 ml A. dest. rekonstituieren
5. Patienten- und Kontrollseren 30 min. im Wasserbad inaktivieren (bereits inaktivierte Seren noch mal 10 min. inaktivieren)
6. PBS-Puffer herstellen; dazu Inhalt eines Tütchens in 1000 ml A. dest. lösen
7. FITC-Konjugat (= Antihuman-Immunglobulin von Ziege; Lyophilisat) in 3 ml A.dest rekonstituieren und 10-15 min. auf dem Rüttler auflösen
8. Sorbent ist gebrauchsfertig
9. Objektträger erst nach dem Temperieren öffnen; Druck auf Testfelder vermeiden
10. Reaktives Kontrollserum 1:5 mit PBS ansetzen: 10 μl reaktives KO-Serum + 40 μl PBS
11. Reaktives Kontrollserum 1:5 mit Sorbent ansetzen: 10 μl reaktives KO-Serum + 40 μl Sorbent
12. Minimal (1+) reaktives Kontrollserum ansetzen (Titer aufgedruckt) 1:500: 10 μl reaktives KO-Serum + 4990 μl PBS
13. Unspezifisches Kontrollserum 1:5 mit PBS ansetzen: 10 μl unspez. KO-Serum + 40 μl PBS
14. Unspezifisches Kontrollserum 1:5 mit Sorbent ansetzen: 10 μl unspez. KO-Serum + 40 μl Sorbent
15. Patientenseren 1:5 mit Sorbent verdünnen: 10 μl Pat.-Serum + 40 μl Sorbent

Pipettierschema

Durchführung

1. Kavität 1: 10 μl Reaktives Kontrollserum 1:5 mit PBS
   Kavität 2: 10 μl Reaktives Kontrollserum 1:5 mit Sorbent
   Kavität 3 : 10 μl Minimal (1+) reaktives Kontrollserum
   Kavität 4 : 10 μl Unspezifisches Kontrollserum 1:5 mit PBS
   Kavität 5: 10 μl Unspezifisches Kontrollserum 1:5 mit Sorbent
   Kavität 6: 10 μl PBS-Puffer (Reagenzkontrolle)
   Kavität 7: 10 μl Sorbent (Reagenzkontrolle)
   Kavität 8: 10 μl Patientenserum
   Kavität 9: 10 μl Patientenserum
   Kavität 10: 10 μl Patientenserum
   Achtung: Alle Testfelder müssen vollständig bedeckt sein! Testfelder nicht mit Pipettenspitze berühren! Kreuzkontamination zwischen einzelnen Auftragsstellen vermeiden!
2. Inkubation: 30 min. bei 37°C in feuchter Kammer
3. Spülen: Objektträger vorsichtig mit PBS abspülen; Flüssigkeitsstrahl nicht direkt auf Testfelder richten; Verschleppung von Serum auf andere Testfelder vermeiden
4. 2 x 10 min. Objektträger in einem Färbetrog mit PBS waschen. Vorsichtig auf dem Rüttler bewegen. Puffer zwischendurch wechseln.
5. Objektträger vorsichtig mit A. dest. abspülen
6. Trocknen: Objektträger mit der Kante aufstoßen, Maske mit Papier trockenen, Lufttrocknen. Objektträger müssen vollständig trocken sein.
7. Konjugat: 10 μl auf jedes Feld auftragen
8. Inkubation: 30 min. bei 37°C in feuchter Kammer im Brutschrank (dunkel) inkubieren
9. Arbeitsschritte 3 bis 6 wiederholen
10. Eindecken: einen kleinen Tropfen Eindeckmedium auf jedes 2. Testfeld geben und vorsichtig ein Deckglas auflegen; Luftblasen vermeiden
11. Lagerung: Bis zur mikroskopischen Beurteilung (max. 4 h) dunkel lagern. Austrocknung vermeiden.
12. Ablesen:
    • Die Beurteilung der Objektträger sollte in einem dunklen Raum stattfinden
    • Testfelder mit nichtreaktiven Ergebnissen müssen im Dunkelfeld auf das Vorhandensein von Treponemen untersucht werden.
    • Als Ablesestandard dient die minimal (1+) reaktive Kontrolle. Die Fluoreszenz aller Kontrollen und Patientenseren nach folgendem Schema protokollieren:
      • 4+ sehr starke Fluoreszenz -> reaktiv
      • 3+ starke Fluoreszenz -> reaktiv
      • 2+ mäßige Fluoreszenz -> reaktiv
      • 1+ schwache Fluoreszenz, entsprechend minimal-KO -> reaktiv
      • <1+ schwächere Fluoreszenz als minimal-KO -> grenzwertig
      • keine oder kaum wahrnehmbar Fluoreszenz -> nichtreaktiv