Vorbereitung

1. Kontroll-Seren ( eingefroren ) vorbereitend:
   Grundverdünnung herstellen 1:10
   10 μl pos. KO-Serum + 90 μl VP (Veronalpuffer)
   10 μl neg. KO-Serum + 90 μl VP (Veronalpuffer)
   
2. Patienten-Seren ( eingefroren ) vorbereiten:
   Grundverdünnung herstellen 1:5
   25 μl Pat.1serum + 100 μl VP
   25 μl Pat.2serum + 100 μl VP
   -> für jeden Patient (für Doppelbestimmung doppelte Menge ansetzten!)
   
3. Verdünnte KO- und Pat.-Seren 30 min. bei 56°C im Wasserbad inkubieren (dadurch wird eigenes Komplement inaktiviert)
4. Cardiolipin-AG vorbereiten (liegt gelöst vor) 1:120 verdünnen
   15 μl AG + 1785 μl VP
   
5. U-Mikrotiterplatte vorbereiten
   
6. 5-10 min. bevor Serum fertig inkubiert hat Komplementverdünnung (2E) herstellen
   2 Einheiten entsprechen einem Verdünnungsfaktor von 1:50
   für eine Platte : 40 μl Komplement + 1960 μl VP (im Reagenzglas ansetzten)
   => Reagenzglas in Eis stecken
   
7. Komplementverdünnung für Komplement-KO ansetzen (in Eppendorfhütchen)
   1,5 E : 50 μl VP + 150 μl Kompl.(2E)
   1,0 E: 100 μl VP + 100 μl Kompl.(2E)
   0,5 E: 150 μl VP + 50 μl Kompl.(2E)
   => Eppendorfhütchen in Eis stecken
   

Pipettierschema

Durchführung

1. 25 μl VP vorlegen: 1./3./4./5./6. Delle einer jeden Reihe und in alle 4 Komplement-KO
2. 25 μl pos. KO-Serum in 1./2./3. Delle der 1. Reihe
   25 μl neg. KO-Serum in 1./2./3. Delle der 2. Reihe
   25 μl Pat.-Serum in 1./2./3. Delle der 3. Reihe
   Verdünnungsreihe anlegen: je 25 μl übertragen von 3.->4.-> 5.->6. /` 25 μl verwerfen
   bei jeder Reihe gleich verfahren
3. 25 μl verdünntes AG (1:120 ) in 2.-6. Delle in allen Reihen und in alle Komplement-KO
4. 25 μl Komplement-Verdünnung (2E) in alle Dellen ( pos.KO, neg.KO, SerumKO und Pat.)
5. 25 μl Komplement-Verdünnung ( 1,5/ 1,0/ 0,5E) in entsprechende Delle der Komplement-KO
6. Rüttler: 10 sek. schütteln
7. Inkubation: 60 min. bei 37°C abgedeckt im Brutschrank
8. Ambozeptor-Gebrauchsverdünnung herstellen 1:25 60 μl Stammlösung + 1440 μl VP
9. Hämolytisches System ansetzen ( für eine Platte )
   1,5 μl Ambozeptor + 1,5 μl Erythrozyten ( 1%, gebrauchsfertig, gut mischen)
   Mischung schwenken (Erys gehen beim Schütteln kaputt!) und 15 min. bei 37°C inkubieren
   ( = sensibilisieren)
10. 50 μl hämolyt. System in alle Dellen pipettieren
11. Rüttler: 10 sek. schütteln
12. Inkubation: 30 min. bei 37°C zugedeckt im Brutschrank (alle 10 min. rütteln)
13. Rüttler: 10 sek. schütteln
14. Zentrifugieren: 5 min. bei 2000 U/min.
15. Ablesen:
    positiv: Sedimentierung der Erys (Knopfbildung )
    negativ: vollständige Hämolyse der Erys ("klar")
    
    Serum-Kontrolle: muß immer negativ sein, da sie kein Antigen enthält!
    Ist sie doch positiv, gilt das Serum als antikomplementär,d.h. falsch positiv! Das Ergebnis dieser Probe darf nicht bewertet werden!
    pos. KO: muß vorab bestimmten Titer aufweisen ( z.B. 1:40 )
    neg. KO: muß negativ sein
    Patienten-Seren: als Titer wird die höchste Verdünnung angegeben, bei der es noch zu einer deutlichen Knopfbildung (= Hemmung der Hämolyse ) kommt. Erfolgt überhaupt keine Knopfbildung, hat der Patient keine Antikörper
    Komplement-KO:
    • 2,0E: vollständige Hämolyse
    • 1,5E: vollständige Hämolyse
    • 1,0E: Hemmung der Hämolyse
    • 0,5E: Agglutination ( Knopf )
    
    1 Einheit Komplement reicht, um alle Erys des Testsystems zu hämolysieren